Biokémiai háttér.
Bevezetés.
2015-ben a Barex kifejlesztette a Lepex nyúlondó-tartósító közeget, amely azóta is forgalomban van. A nyúl szaporodásával kapcsolatos biokémiai mechanizmusokról szerzett új ismeretek vezettek a Novum (Novum az Új Ovulációs Közegből) új kiegészítőjének megtervezéséhez. A Novum kiegészítő az ondóhígítóhoz adva úttörő módon támogatja az ovuláció indukcióját. A Novumban található összetevőket kifejezetten úgy tervezték, hogy segítsék a bak ondójában természetesen jelenlévő béta idegnövekedési faktor (NGF) fehérjét az ovuláció kiváltásában. A természetes ovulációs folyamatban részt vevő különböző molekuláris mechanizmusok támogatásával a Novum lehetővé teszi a természetes párzás által kiváltott ovulációt. A következő bekezdésekben a Novum fejlesztésének kulcsfontosságú elemeibe, valamint a nyulak szaporodásának molekuláris folyamataiba nyújtunk részletes betekintést.
Az európai nyulak a Leporidae családba tartozó kisemlősök. A kőkorszakban a hominidák nagy számban vadászták és fogyasztották őket a Földközi-tenger északnyugati területein, Spanyolországtól Olaszországig. A föníciaiak, akik a Földközi-tenger egész területén kereskedtek Ciprustól az Ibériai-félszigetig, valószínűleg elindították a nyúl terjedését. A rómaiak felfedezték a nyulat mint élelmiszerforrást, és a Római Birodalomban folytatott kereskedelem tovább terjesztette a nyulakat az Ibériai-félszigetről a világ más részeire. A háziasítás a 18. századig tartott. Ma a nyulakat nagyobbá és kövérebbé tenyésztik, hogy több húst kapjanak. Világszerte számos kultúrában elterjedtek, és a mindennapi élet részét képezik élelmiszerként, ruházatként, társként és művészeti inspiráció forrásaként. A nyulakat kutatási modellként használják az alaptudományban, és az alkalmazott tudományban többek között antitestek előállítására, amelyek embereknél is felhasználhatók, vagy emberi betegségek tanulmányozására.
2. Nyúlhústermelés.
A nyúl jó húsforrás az állati fehérje iránti igény kielégítésére. Optimális tenyésztési programmal egy nőstény nyúl (anya) évente 60 fiatal nyulat képes produkálni, ami több mint 100 kg nyúlhúst jelent. Ezenkívül a nyulak szaporodási rátája magasabb más haszonállatokhoz képest. Korábban válnak ivaréretté, viszonylag rövid a vemhességi idejük, és azonnal újra tenyészthetők az ellés után. A nyúl nőstények mesterséges megtermékenyítése (AI) az 1980-as évek végén jelent meg az európai gazdaságokban. Korábban az állatok genetikai javítására és egészségügyi problémák megoldására használták. Később jelentős javulásokat értek el mind a termelési, mind a gazdasági szempontok tekintetében. A nyulak mesterséges megtermékenyítésének technikája folyamatosan fejlődik.
Tisztelt Kollégák!
Az elkövetkező évtizedekben az állattenyésztési termékek iránti kereslet növekedni fog a világ népességének drámai emelkedésével, emellett a fogyasztók egyre tudatosabbá válnak és magas minőségű termékeket igényelnek. A nyúltenyésztés, amely különösen fontos a mediterrán térségben és Afrika, Ázsia vagy Amerika félszáraz övezeteiben, értékes alternatív forrása a jó minőségű állati fehérjének (alacsony zsírtartalom és alacsony koleszterinszint). Mivel a nyulakat világszerte választják haszonállatfajként szaporodási és takarmányozási előnyeik miatt, a modern nyúltenyésztésnek néhány fontos jövőbeli kihívással kell szembenéznie, amelyeket a következő néhány évben meg kell oldani annak biztosítására, hogy versenyképes és fenntartható ágazat maradjon. Különböző stratégiákat kell alkalmazni a nyulak jóléte, a fogyasztói igények és a tenyésztői követelmények közötti egyensúly fenntartására. Javítani kell a tenyésztési rendszereket, és ez magában foglalhatja a hormonok és antibiotikumok elkerülését; a szaporodási eljárások, például a mesterséges megtermékenyítési rendszerek vagy az ondó és embriók fagyasztásának hatékonyságának növelését; a nőstények termékeny élettartamának meghosszabbítását; valamint a táplálkozási rendszerek módosítását az állatok fiziológiai állapotának optimalizálása érdekében. Ez a különszám célja az volt, hogy magas minőségű kéziratokat, beleértve eredeti kutatási tanulmányokat és áttekintéseket, tegyen közzé, amelyek főként ezen témák bármelyikével foglalkoznak a nyúltermelékenység és a fenntarthatóság növelése érdekében.
Dr. Rosa María García-García
Dr. Maria Arias Alvarez
Vendégszerkesztők
3. Mesterséges megtermékenyítés nyulaknál.
A mesterséges megtermékenyítés kereskedelmi felhasználása a nyúltenyésztésben viszonylag újkeletű. A mesterséges megtermékenyítés nagyszabású alkalmazása a nyúltenyésztésben az 1980-as évek végén kezdődött. A nyulak mesterséges megtermékenyítésének köszönhetően alacsony munkaerőköltséggel növelhető a kiváló minőségű termékek mennyisége, szemben a természetes párzással. Könnyebb minőségi feltételeket teremteni kis számú hím tartásához. A friss ondóval végzett mesterséges megtermékenyítés utáni fogamzási arányok megegyeznek vagy akár jobbak is, mint a természetes párzással elértek.
További előnyök: szabályozható az utódok minősége, növelhető az értékes, funkcionális tulajdonságokkal rendelkező egyedek száma, meghosszabbodik a termékenység még az év kedvezőtlen időszakaiban is, egész éves ciklus alapú termelés, és hatékonyabb tenyésztési programok.
A mesterséges megtermékenyítést korábban, a nagyszabású alkalmazások előtt, az állatok genetikai javítására és egészségügyi problémák megoldására használták. Később azonban jelentős javulásokat értek el mind a termelési, mind a gazdasági szempontok tekintetében, például a magas genetikai értékű kívánatos tulajdonságok felgyorsítását az ondó megőrzésével támogatva.
A mesterséges megtermékenyítés szisztematikus alkalmazása az intenzív nyúltenyésztésben az egyik leghatékonyabb megközelítés a kiváló minőségű vagy genetikai értékű bakok ejakulátumainak elosztására. Röviden: a mesterséges megtermékenyítés lehetőséget kínált a nagy gazdaságoknak a nyúlhús rendkívül gazdaságos termelésének feltételeinek optimalizálására.
Sok emlős esetében az ovulációt az érett petefészkekből felszabaduló petefészek-szteroidok szabályozzák. Ezek a szteroidok kiváltják a gonadotropin-felszabadító hormon (GnRH) felszabadulását a hipotalamuszból. Ezeket az emlősöket spontán ovulálóknak nevezik.
A nyulak azonban indukált ovulálók. Ez azt jelenti, hogy az ovulációt a párzás váltja ki, amely GnRH szekréciót indít el. Így, ha a nagyszabású nyúltenyésztésben a természetes párzás helyett mesterséges megtermékenyítést alkalmaznak, gonadotropin-felszabadító hormont (GnRH) kell alkalmazni az ovuláció kiváltására.
A GnRH alkalmazása többféleképpen történhet, de főként a nőstény intramuszkuláris injekciójával vagy intravaginális adagolásával.
Kereskedelmi forgalomban kapható szintetikus GnRH állatgyógyászati készítmények például az MSD Animal Health (az amerikai Merck & Co része) Receptalja és a Fatro (olaszországi székhelyű) Dalmarelinje. A Receptal 4,2 mcg buserelint tartalmaz ml-enként, a Dalmarelin pedig 25 mcg lecirelint ml-enként.
Intramuszkuláris injekció után az agonista felszívódik az izomszövet ereibe és eloszlik a rendszerben. Azonnali válasz….
Az agonista vérbe jutása azonnali luteinizáló hormon felszabadulást okoz az elülső agyalapi mirigyből, ami ovulációhoz vezet.
Körülbelül tízszer több agonista szükséges az intravaginális adagoláshoz, mivel a GnRH molekuláknak át kell haladniuk a hüvelyfalon, hogy elérjék az ereket. A falon való áthaladás mellett a hüvelyi környezet ellenséges a külső fehérjékkel szemben.
5- A GnRH hormon
A hormon egy szabályozó anyag, amelyet egy szervezet termel, és szöveti folyadékokban, például vérben szállítódik, hogy specifikus sejteket vagy szöveteket cselekvésre ösztönözzön. A gonadotropin hormon egy olyan hormon, amely a gonádokra hat vagy stimulálja azokat, azaz egy olyan szervet, amely spermiumokat (here) vagy petesejteket (petefészek) termel.
A gonadotropin-felszabadító hormon (GnRH) egy felszabadító hormon, amely a follikulusstimuláló hormon (FSH) és a luteinizáló hormon (LH) elülső agyalapi mirigyből történő felszabadulásáért felelős. A GnRH egy tropikus peptid hormon, amelyet a hipotalamuszban található GnRH neuronok szintetizálnak és bocsátanak ki.
A GnRH egy kis fehérje vagy peptid, amely 10 aminosavból áll.
A GnRH identitását az 1977-es Nobel-díjasok, Roger Guillemin és Andrew V. Schally tisztázták. A GnRH felezési ideje mindössze 2-4 perc, mivel a molekulát proteolitikus enzimek, azaz peptidázok gyorsan lebontják. A rövid felezési idő volt az oka annak, hogy GnRH analógokat szintetizáltak, hogy növeljék hatékonyságukat és hatásuk időtartamát emberi gyógyszerek alkalmazására.
Emlősöknek történő beadásra szintetikus GnRH-t használnak. Ezeket a molekulákat GnRH agonistáknak vagy analógoknak nevezik. Szintetikus GnRH-t használnak az ovuláció kiváltására nyulaknál. Ezeket a molekulákat GnRH agonistáknak vagy analógoknak nevezik. Az analógok kissé eltérnek a természetes (emberi) GnRH dekapeptidtől, de specifikus módosításokkal. Ezek a módosítások specifikus aminosavak (a 6. aminosav pozícióban) egyszeres vagy kétszeres szubsztitúciói. De előfordulnak változások a 9. pozícióban (alkilezés) vagy a tizedik pozíció törlése is. Ezek a módosítások gátolhatják a gyors lebomlást a testfolyadékokban, miközben fenntartják a funkciót. Két aminosav szubsztitúcióval rendelkező agonisták a leuprorelin, buserelin, goserelin és deslorelin. Az ágens nafarelin és triptorelin egyetlen szubsztitúcióval rendelkező agonisták a 6. pozícióban.
6. NGF-indukált ovuláció mint alternatíva.
Néhány évvel ezelőttig azt hitték, hogy a nyulak ovulációját csak a párzás válthatja ki. Az elképzelés az volt, hogy az indukált ovulálóknál a GnRH felszabadulásában szerepet játszó elsődleges mechanizmus a noradrenerg neuronok aktiválódásából áll, válaszul a nemi szervek szomatoszenzoros jeleire, amelyeket a hím behatolása generál a párzás során. Ezek a noradrenerg neuronok ezután elősegítenék a GnRH felszabadulását. Azonban a nyulak szaporodásának molekuláris alapjaival kapcsolatos legújabb kutatások azt mutatják, hogy a béta idegnövekedési faktor (NGF) fehérje létfontosságú szerepet játszik ovulációt kiváltó faktorként.
Az idegnövekedési faktor (NGF) egy fehérje és neurotróf faktor, amely szabályozza a specifikus célneuronok növekedését, fenntartását, proliferációját és túlélését. De sok évvel a felfedezése után világossá vált, hogy az NGF létfontosságú szerepet játszik a szaporodásban is, különösen az ovulációt kiváltó fajoknál.
Az NGF célsejtekre gyakorolt hatását két receptor közvetíti: a tropomiozin receptor kináz A (TrKA), amely szelektíven kötődik.
NGF, és a p75 neurotrofin receptor. Ezek a receptorok a nőstény szaporítószerveinek több helyén is megtalálhatók.
A receptorokkal való kölcsönhatás révén az NGF fehérje ovulációt indukál, de befolyásolja a nőstény szaporítószervét az ovuláció alatt és után is. Továbbá szerepet játszik a biokémiai környezetben a korai embriófejlődés során.
Az NFG kétféle mechanizmussal hathat ovulációt indukáló faktorként a nőstény szaporítószervében. Először is, az NFG stimulálhatja a méh és a méhnyak érző idegsejtjeit, amelyek neuronokat váltanak ki a hipotalamuszban. Másodszor, az NFG további NFG szintézist okozhat a szaporítószervben, amely az ondóból származóval együtt a vérrel szállítódik és a agyat célozza meg, végső soron GnRH felszabadulást eredményezve.
Az NFG kritikus szerepére vonatkozó legmeggyőzőbb bizonyíték az, hogy a szintetikus NFG (a nyulakban található NFG-vel azonos rekombináns fehérje) hígított ondóhoz adva intravaginális úton ovulációt és fogamzást indukál. Az ovuláció dózisfüggő módon jön létre. Egészséges utódok születtek, a GnRH-hoz képest nem volt különbség.
A következő kép rajzolódik ki. Körülbelül 1 ml ejakulátum, amely körülbelül 300 millió spermiumot tartalmaz, az ondóplazmában szuszpendálva, amely NGF-et tartalmaz, a párzás során lerakódik. Az NGF hatására számos molekuláris és celluláris funkció sorozata indul el. Amikor a spermiumok elérik a petevezetéket, nyulaknál percek alatt, a spermiumoknak csak kis része tapad a petevezeték hámjához. Az ovuláció körülbelül tíz órával a közösülés után indukálódik, és a megtermékenyítés 2-3 órával az ovuláció után történik. Mindezek az események az endokrin és idegi kölcsönhatás eredményei, amelyek a párzáshoz kapcsolódnak, és az NFG kulcsszerepet játszik.
Az NGF alternatívát jelent a GnRH használatára. Sőt, várhatóan az NGF fontos szerepet fog játszani a mesterséges megtermékenyítés jövőjében sok más állatfajnál is.
7. A Lepexben lévő mátrix javítja az NGF-indukált ovuláció működését?
A Lepex nyúlondó-hígító Matrixot, egy polimert tartalmaz. Mint fentebb írtuk, ezt a hígítót 2015-ben fejlesztették ki, és a Peter Rutjens Nyúl Mesterséges Megtermékenyítő Állomáson használták. A közelmúltban végzett kísérletekben, amelyek specifikus antibakteriális peptidek alkalmazására irányultak, jó teljesítményt figyeltek meg GnRH-analóg intramuszkuláris injekciója nélkül. Ez arra engedett következtetni, hogy a Matrix valamilyen módon javította az NGF-indukált ovuláció működését.
A Matrix molekuláris mechanizmusa a hígító alkalmazásában többrétű; először is, a spermiumok kevésbé tapadnak össze; másodszor, kevesebb a hígított ondó visszafolyása a megtermékenyítés után; harmadszor, és ami a legfontosabb, a Matrix nyálkahártya-tapadóként működik. Ezen a ponton feltételeztük, hogy kísérleteink váratlan pozitív eredményét az NGF-közvetített ovuláció javulása okozta nyulaknál, a Matrix elsődleges szerepével.
Matrix, új szerep az NGF alkalmazásában
2012-ben és 2013-ban a Barex különböző polimereket vizsgált sertésondó tartósító közegekben való alkalmazásra, hogy megakadályozza a sejtek kicsapódását a hígításban a polimer háromdimenziós hálózatának jelenléte által. Ez analóg lenne a polimer karragén hatásával a csokoládétejben, amely megakadályozza a kakaórészecskék kicsapódását.
A Barex több tucat polimer gyűjteményével kezdte. Az in vitro kutatások, nevezetesen a spermiumok mozgékonyságának tárolás alatti elemzése a Hamilton Thorne CEROS II számítógéppel segített ondóelemző rendszerével, után három potenciális jelöltet találtunk. Az inszeminációs tesztekkel történő további szelekció után egyetlen polimer maradt, specifikus molekulatömeg-tartománnyal. Ezt a polimert Matrixnak nevezték el.
A Matrixot széles körben tesztelték sertéseken. Az első kísérletek azt mutatták, hogy egyetlen inszemináció elegendő volt a kocák vemhességéhez, szemben a jelenlegi két inszeminációs gyakorlattal. A Matrixot a sertésondó hígító közegében több mint két éven keresztül tesztelték különböző hollandiai gazdaságokban. A következtetés az volt, hogy egyetlen inszeminációval a Matrixot tartalmazó közeg 2-4%-kal növelte az ellési arányt, és 0,9-1,7 malaccal növelte az alomméretet almonként.
Sajnos a hígítókat és a mesterséges megtermékenyítéshez szükséges fogyóeszközöket gyártó és forgalmazó nagyvállalatok nem érdeklődtek a Matrix iránt, mert az mindig jelentősen csökkentené a forgalmukat. Végül is csak egyszer volt szükség egyetlen megtermékenyítésre a kettő helyett.
Miután kutatták a Matrix alkalmazását a sertésondó-hígítókban, a Barex elkezdte egy nyúlondó-hígító fejlesztését. 2015-ben a Barex sikeresen létrehozta a Lepexet. Az alábbi kép a Lepexben hígított nyúlondó mozgékonyságát mutatja 17°C-on történő tárolás során.
A Matrix pozitív hatást mutatott a Lepex tárolási kapacitására. Ez és más kísérletek is azt mutatták, hogy a Lepex jobb tárolási kapacitással rendelkezik, mint más kereskedelmi forgalomban kapható nyúlondó-hígítók.
Várható volt, hogy a Matrix a nyulak szaporodási teljesítményére is pozitív hatással lesz. Több feltáró kísérlet után a Matrix optimális százalékos arányát egy nagyszabású terepkísérletben határozták meg.
Az alábbi kép az eredményeket mutatja. Optimális Matrix koncentráció esetén a vemhességi arány 4-5%-kal magasabb, és az élve született alomméret majdnem eggyel magasabb, mint a Matrix nélküli hígítóval.
Porex, Porexcell és Pronexcell.
Sok évvel ezelőtt a Barex véletlenül felfedezte a tejsavó-izolátumok pozitív hatását a sertés sperma hígítók tárolási kapacitására. Egy bizonyos márkájú tejsavó-izolátum 1%-ának hozzáadását Porexnek nevezték el. A Porexet az IMV Technologies hígítójában, a TRIXCellben tesztelték. A TRIXcell+ volt a Porexet tartalmazó hígító. A hatéves inszeminációs kísérletek során 35 résztvevő gazdaságban minden évben magasabb volt az ellési arány és az élve született malacok száma, amikor a TRIXcell+-t használták a referens hígító, a BTS helyett. Ez magasabb ellési arányt és nagyobb alomméretet eredményezett.
A TRIXcell+ átlagosan 0,6-tal növelte az élve született malacok számát. Korábbi tanulmányok szerint a TRIXcell hasonló ellési arányt és alomméret-teljesítményt mutatott, mint a BTS (Haugan et al., 2007).
A hígító adalékanyagát Porexnek nevezték el. A Porex további fejlesztése a szójalecitin hozzáadása volt. A hozzáadásával a nevet Porexcellre változtatták. Mind a Porex, mind a Porexcell sok éven át használatos volt sertés sperma hígítókban.
2014 körül nyilvánvalóvá vált, hogy a Porexcell pozitív hatása csökkent, sőt negatívan befolyásolta a sertés sperma hígítók tartósítási kapacitását. Kiderült, hogy az évek során egyre több növényvédő szert tartalmazott. Ez a negatív hatás a hígított sperma tárolása során a motilitásra nem volt észrevehető a mén sperma hígítókban vagy a nyúl sperma hígítókban. Úgy tűnik, hogy a sertés spermiumok rendkívül érzékenyek a növényvédő szerekre. Erőfeszítéseket tettek egy növényvédő szerek nélküli termék kifejlesztésére; mivel nem akartuk, hogy a fejlesztés befolyásolja a mén és nyúl spermiumokat, végül egy tejből származó, de a tejsavófehérjénél tisztább fehérjekeverékre váltottunk. Az új terméket Pronexcellnek nevezték el. A mai napig a Pronexcellt használják a Hippex mén sperma hígítókban és a Lepex nyúl sperma hígítóban.
Ezen fehérjék pozitív hatásai hozzájárulnak a Matrix teljesítményéhez.
8. Matrixcell.
A kezdeti kísérletek eredményei azt mutatták, hogy a Novum nagyon jól teljesít. További összetevőket kellett hozzáadni a GnRH használatához hasonló teljesítmény eléréséhez. Amint fentebb írtuk, az NGF fehérje két receptorral, a TrkA-val és a p75-tel lép kölcsönhatásba, amelyek a női reproduktív traktusban megtalálhatók az ovuláció kiváltására. Több receptor aktiválása szükséges, és a válasz közvetlenül arányos az NGF-receptor találkozások számával időegységenként. A hatékony jelátvitel megfelelő koncentrációkat és megfelelő biokémiai környezetet igényel. A sperma hígító biokémiai környezete nagyon eltér a hüvelyi nyákétól. A női reproduktív traktus felületét nyák borítja, egy komplex viszkoelasztikus gél, amely az első védelmi vonalat képezi a külső környezetből származó káros anyagokkal szemben. A nyák számos biológiai funkcióban alapvető szerepet játszik. A nyák ad otthont a hüvelyi flórának, amely kritikus a hüvelyi nyálkahártya-gát fenntartásában. A hígított sperma nyákkal való keveredésének javítása és az NGF receptorokkal való kölcsönhatásának lehetővé tétele érdekében a Matrixcell a Novum egyik kritikus összetevője.
Matrixcell.
Az NGF receptorokhoz való eljuttatását a női reproduktív traktusban befolyásolhatja a nyák a hám számos redőjében, üregében és gerincében, amelyek növelik a hüvely felületét és biztosítják a tágulékonyságot. Ezenkívül a szivárgás csökkentheti a receptorokkal való kölcsönhatáshoz rendelkezésre álló NGF mennyiségét. Mesterséges megtermékenyítés alkalmazásakor kevesebb a hüvelyi folyadékdinamika és a természetes biomechanikai erő, mint természetes párosodás esetén.
Így az NGF aktivitás hatékonysága megfelelő koncentrációktól és a reproduktív traktus falainak felületén való megtartásától függ. A nyálkahártyához tapadó Matrix sikeresnek bizonyult, meghosszabbítva az NGF jelenlétét a nyálkahártyában a nyákkal fizikai és kémiai kötések kialakításával. Azonban az NGF nyákba való behatolásának javítása érdekében a Matrixcellt használták, amely a Matrix tisztább és finomabb formája.
A nyákba való behatolás különböző fázisokat foglal magában. Az első fázis az inszeminációs közeg és a nyák közötti intim érintkezés kialakítása, és magában foglalja a közeg szétterítését. A második fázisban a Matrix polimerek és a nyák glikoproteinek közötti kölcsönös behatolás történik a két makromolekuláris faj közötti fizikai összefonódások kialakításával. Különösen a Matrixcell teljesít jobban, mint a Matrix ebben a fázisban, amint azt in vitro kísérletek is igazolták. A harmadik fázisban konszolidáció történik, amely megerősíti a Matrix polimer-mucin kötést Van der Waals erők és hidrogénkötések létrehozásával.
9. NGF felezési ideje
A peptidázok jelenléte mind a hígított spermában, mind a női reproduktív traktusban befolyásolja az NGF felezési idejét az inszeminációs dózisban. Peptidázok találhatók a nyúl ondóplazmájában, elsősorban a mellékheréből és a járulékos nemi mirigyekből származva, míg a mikrobák kolonizálják a női reproduktív traktust és peptidázokat is szekretálnak. Mind a sperma, mind a hüvelyi folyadék fehérjebontó enzimeket tartalmaz.
A hígítóban lévő Matrixcell gélként működik az NGF felezési idejének meghosszabbítására. Ezenkívül az NGF fehérjék felezési idejét meghosszabbították fehérjebontó enzimek inhibitorainak, kompetitív peptideknek és fehérjéknek (többek között Pronexcell) koktéljának hozzáadásával.
10. Záró megjegyzések
A nyulak szaporodásával kapcsolatos új felismerések vezettek az új sperma hígító kiegészítő, a Novum kifejlesztéséhez. A Novum különböző egyedi összetevői támogatják azokat a molekuláris mechanizmusokat, amelyek a nyulak ovulációjához és vemhességéhez vezetnek. A Novum kiváló teljesítményét számos kísérlet igazolta különböző helyszíneken, több országban.
