Contexto bioquímico.
Introdução.
Em 2015, a Barex desenvolveu o meio de preservação de sémen de coelho Lepex, que tem estado no mercado desde então. Recentemente, novos conhecimentos sobre os mecanismos bioquímicos relacionados com a reprodução de coelhos levaram à conceção do novo suplemento Novum (Novum de Novo Meio de Ovulação). O suplemento Novum, quando adicionado ao diluidor de sémen, é uma forma inovadora de apoiar a indução da ovulação. Os ingredientes presentes no Novum são especificamente concebidos para auxiliar a proteína fator de crescimento nervoso beta (NGF) naturalmente presente no sémen do coelho macho a induzir a ovulação. Ao apoiar diferentes mecanismos moleculares envolvidos no processo natural de ovulação, o Novum permite a ovulação induzida por acasalamento natural. Nos parágrafos seguintes, iremos aprofundar os elementos cruciais do desenvolvimento do Novum e fornecer detalhes intrincados sobre os processos moleculares de reprodução em coelhos.
Os coelhos europeus são pequenos mamíferos pertencentes à família Leporidae. Foram caçados e comidos por hominídeos durante a Idade da Pedra em grande número nas áreas do noroeste do Mediterrâneo, de Espanha a Itália. Os Fenícios, que comerciavam por toda a área do Mediterrâneo, desde Chipre até à Península Ibérica, provavelmente iniciaram a propagação do coelho. Os Romanos descobriram o coelho como fonte de alimento, e o comércio no Império Romano espalhou ainda mais os coelhos da Península Ibérica para outras partes do mundo. A domesticação durou até ao século XVIII. Hoje, os coelhos são criados maiores e mais gordos para obter mais carne. São introduzidos em todo o mundo em muitas culturas e fazem parte da vida quotidiana como alimento, vestuário, companhia e fonte de inspiração artística. Os coelhos são utilizados como modelo de investigação em ciência fundamental, e na ciência aplicada, os coelhos são utilizados, entre outros, para a produção de anticorpos que podem ser utilizados em humanos ou para estudar doenças humanas.
2. Produção de carne de coelho.
O coelho é uma boa fonte de carne para satisfazer a procura de proteína animal. Com um programa de reprodução ideal, uma coelha (fêmea) pode produzir 60 coelhos jovens por ano, representando mais de 100 kg de carne de coelho. Além disso, os coelhos têm uma taxa reprodutiva elevada em comparação com outros animais de criação. Atingem a maturidade sexual mais cedo, têm um período de gestação relativamente curto e podem ser novamente acasalados imediatamente após o parto. A inseminação artificial (IA) de coelhas fêmeas surgiu nas explorações europeias no final da década de 1980. Foi utilizada anteriormente para obter a melhoria genética dos animais e resolver problemas sanitários. Posteriormente, foram alcançadas melhorias significativas tanto nos aspetos produtivos como económicos. A técnica de inseminação artificial de coelhos continua a evoluir.
Caros colegas,
Nas próximas décadas, a procura de produtos pecuários aumentará com o aumento dramático da população mundial, além de os consumidores se tornarem mais conscientes e exigentes de produtos de alta qualidade. A cunicultura, particularmente importante na área mediterrânica e nas zonas semiáridas de África, Ásia ou América, representa uma valiosa fonte alternativa de boa proteína animal de alta qualidade (baixo teor de gordura e baixo colesterol). Como os coelhos estão a ser escolhidos, em todo o mundo, como uma espécie pecuária devido às suas vantagens reprodutivas e alimentares, a criação moderna de coelhos enfrentará alguns desafios futuros importantes que devem ser resolvidos nos próximos anos para garantir que continue a ser um setor competitivo e sustentável. Devem ser utilizadas diferentes estratégias para manter um equilíbrio entre o bem-estar dos coelhos, as exigências dos clientes e os requisitos dos criadores. É necessária uma melhoria nos sistemas de reprodução, que pode envolver evitar hormonas e antibióticos; melhorar a eficiência dos procedimentos reprodutivos, como sistemas de inseminação artificial ou congelação de sémen e embriões, entre outros; prolongar a vida produtiva das coelhas; e ajustar os sistemas nutricionais para otimizar o estado fisiológico dos animais. Esta Edição Especial teve como objetivo publicar manuscritos de alta qualidade, incluindo estudos de investigação original e revisões, que abordam principalmente qualquer um destes tópicos no aumento da produtividade e sustentabilidade dos coelhos.
Dra. Rosa María García-García
Dra. Maria Arias Alvarez
Editoras convidadas
3. Inseminação artificial em coelhos.
A utilização comercial da IA na criação de coelhos é relativamente recente. A utilização em larga escala da IA na criação de coelhos começou no final da década de 1980. Graças à IA de coelhos, é possível aumentar o volume de produtos de alta qualidade obtidos com baixos custos de mão-de-obra, em oposição à utilização do acasalamento natural. Criar condições de qualidade para manter um pequeno número de machos é mais fácil. As taxas de conceção após IA com sémen fresco são equivalentes ou até melhores do que as obtidas por acasalamento natural.
Outras vantagens são: pode-se controlar a qualidade da descendência, aumentar o número de indivíduos com características valiosas e funcionais, fertilidade prolongada mesmo durante períodos desfavoráveis do ano, produção baseada em ciclo durante todo o ano e programas de reprodução mais eficientes.
A IA foi utilizada anteriormente, antes das aplicações em larga escala, para obter a melhoria genética dos animais e resolver problemas sanitários. No entanto, foram posteriormente alcançadas melhorias significativas tanto nos aspetos produtivos como económicos, como a aceleração das características desejáveis de alto valor genético apoiadas pela preservação do sémen.
A utilização sistemática da IA na produção intensiva de coelhos é uma das abordagens mais eficazes para distribuir ejaculados de machos de qualidade superior ou valor genético. Em resumo: a IA ofereceu às grandes explorações a oportunidade de otimizar as condições para a produção altamente económica de carne de coelho.
Muitos mamíferos consideram que a ovulação é regulada por esteroides ováricos libertados pelos ovários maduros. Estes esteroides provocam a libertação da hormona libertadora de gonadotropina (GnRH) pelo hipotálamo. Estes mamíferos são chamados ovuladores espontâneos.
Os coelhos, no entanto, são ovuladores induzidos. Isto significa que a ovulação é induzida pelo acasalamento, que desencadeia a secreção de GnRH. Assim, quando se utiliza a IA em vez do acasalamento natural na criação de coelhos em larga escala, é necessário aplicar uma hormona libertadora de gonadotropina (GnRH) para induzir a ovulação.
A aplicação de GnRH pode ser feita de várias formas, mas é principalmente feita através de injeção intramuscular na coelha ou administração intravaginal.
Exemplos de GnRH sintético disponível comercialmente como medicamentos veterinários são o Receptal da MSD Animal Health (parte da Merck & Co, sediada nos EUA) e o Dalmarelin da Fatro (sediada em Itália). O Receptal contém 4,2 mcg de buserelina por ml, e o Dalmarelin contém 25 mcg de lecirelina por ml.
Após a injeção intramuscular, o agonista é absorvido nos vasos sanguíneos do tecido muscular e distribuído no sistema. Resposta imediata…
A entrada do agonista no sangue causa uma libertação imediata de hormona luteinizante da hipófise anterior, resultando na ovulação.
É necessário cerca de dez vezes mais agonista para a administração intravaginal, uma vez que as moléculas de GnRH precisam de passar a parede vaginal para atingir os vasos sanguíneos. Além da passagem pela parede, o ambiente vaginal é hostil à proteína externa.
5- A Hormona GnRH
Uma hormona é uma substância reguladora produzida num organismo e transportada nos fluidos dos tecidos, como o sangue, para estimular células ou tecidos específicos à ação. Uma hormona gonadotropina é uma hormona que atua ou estimula as gónadas, ou seja, um órgão que produz células espermáticas (testículo) ou células ovulares (ovário).
A hormona libertadora de gonadotropina (GnRH) é uma hormona libertadora responsável pela libertação da hormona folículo-estimulante (FSH) e da hormona luteinizante (LH) da hipófise anterior. A GnRH é uma hormona peptídica trópica sintetizada e libertada pelos neurónios GnRH dentro do hipotálamo.
A GnRH é uma pequena proteína ou peptídeo constituído por 10 aminoácidos.
A identidade da GnRH foi esclarecida pelos Prémios Nobel de 1977, Roger Guillemin e Andrew V. Schally. A meia-vida da GnRH é de apenas 2-4 minutos, uma vez que a molécula é rapidamente degradada por enzimas proteolíticas, também denominadas peptidases. A curta meia-vida foi a razão pela qual foram sintetizados análogos da GnRH para aumentar a sua potência e duração de ação para aplicações como medicamentos humanos.
Para administração a mamíferos, é utilizada GnRH sintética. Estas moléculas são chamadas agonistas ou análogos da GnRH. A GnRH sintética é utilizada para induzir a ovulação em coelhos. Estas moléculas são chamadas agonistas ou análogos da GnRH. Os análogos diferem ligeiramente do decapeptídeo GnRH natural (humano), mas com modificações específicas. Estas modificações são substituições simples ou duplas de aminoácidos específicos (na posição 6 do aminoácido). Mas também ocorrem alterações na posição 9 (alquilação) ou deleção da posição dez. Estas modificações podem inibir a rápida degradação nos fluidos corporais, mantendo a função. Os agonistas com duas substituições de aminoácidos são a leuprorrelina, buserelina, goserrelina e deslorelina. Os agentes nafarelina e triptorelina são agonistas com substituições únicas na posição 6.
6. Ovulação induzida por NGF como alternativa.
Até há alguns anos, pensava-se que a ovulação em coelhos só podia ser induzida pela cópula. A noção era de que o mecanismo primário envolvido na libertação de GnRH entre os ovuladores induzidos consiste na ativação de neurónios noradrenérgicos em resposta a sinais somatossensoriais genitais gerados pela receção de uma intromissão de um macho durante o acasalamento. Estes neurónios noradrenérgicos promoveriam então a libertação de GnRH. No entanto, investigações recentes sobre a base molecular da reprodução em coelhos indicam que a proteína fator de crescimento nervoso beta (NGF) desempenha um papel vital como fator indutor da ovulação.
O fator de crescimento nervoso (NGF) é uma proteína e fator neurotrófico que regula o crescimento, manutenção, proliferação e sobrevivência de neurónios-alvo específicos. Mas muitos anos após a sua descoberta, tornou-se claro que o NGF também desempenha um papel vital na reprodução, particularmente em espécies com ovulação induzida.
O efeito do NGF nas células-alvo é mediado por dois recetores: o recetor de quinase A da tropomiosina (TrKA), que se liga seletivamente.
ao NGF, e o recetor de neurotrofina p75. Estes recetores estão em vários locais do trato reprodutivo da coelha.
Através da interação com os recetores, a proteína NGF induz a ovulação, mas também afeta o trato reprodutivo da coelha durante e após a ovulação. Além disso, também tem um papel no ambiente bioquímico durante o desenvolvimento embrionário precoce.
O NGF pode atuar como um fator de indução ovulatória por dois tipos de mecanismos no trato reprodutivo feminino. Primeiro, o NGF pode estimular os neurónios sensoriais uterinos e cervicais, que ativam neurónios no hipotálamo. Segundo, o NGF pode causar a síntese adicional de NGF no trato reprodutivo, que, juntamente com o derivado do sémen, é transportado pelo sangue e tem como alvo o cérebro com a libertação final de GnRH.
A evidência mais convincente para o papel crítico do NGF é que o NGF sintético (uma proteína recombinante idêntica ao NGF encontrado em coelhos) adicionado ao sémen diluído induz a ovulação e a conceção por via intravaginal. A ovulação é gerada de forma dependente da dose. Houve descendência saudável sem diferença em comparação com a GnRH.
A imagem seguinte emerge. Cerca de 1 mL de ejaculado contendo cerca de 300 milhões de espermatozoides suspensos em plasma seminal contendo NGF é depositado durante o acasalamento. Através da ação do NGF, uma série de várias funções moleculares e celulares é iniciada. Quando os espermatozoides chegam ao oviduto, em minutos nos coelhos, apenas um pequeno número de espermatozoides se fixa ao epitélio ovidutal. A ovulação é induzida cerca de dez horas após o coito, e a fertilização ocorre 2–3 horas após a ovulação. Todos estes eventos resultam da interação endócrina e neuronal ligada ao acasalamento, com o NGF desempenhando um papel crucial.
O NGF apresenta uma alternativa ao uso de GnRH. Além disso, espera-se que o NGF desempenhe um papel essencial no futuro da IA em muitos outros animais.
A matriz no Lepex melhora o funcionamento da ovulação induzida por NGF?
O diluidor de sémen de coelho Lepex contém Matrix, um polímero. Como mencionado acima, este diluidor foi desenvolvido em 2015 e utilizado na Estação de IA de Coelhos Peter Rutjens. Em experiências recentes que visavam o uso de peptídeos antibacterianos específicos, foi notado um bom desempenho sem o uso de injeção intramuscular de um análogo de GnRH. Isso levou-nos a supor que a Matrix, de uma forma ou de outra, melhorou o funcionamento da ovulação induzida por NGF.
O mecanismo molecular da Matrix na aplicação do diluidor é múltiplo; primeiro, as células espermáticas aglomeram-se menos; segundo, há menos refluxo de sémen diluído após a inseminação; e terceiro, e mais importante, a Matrix atua como um mucoadesivo. Nesse ponto, supusemos que o resultado positivo inesperado das nossas experiências foi causado pela melhoria da ovulação mediada por NGF em coelhos, com um papel principal da Matrix.
Matrix, um novo papel na aplicação do NGF
Em 2012 e 2013, a Barex investigou diferentes polímeros para aplicar em meios de preservação para sémen de suínos para evitar a precipitação das células na diluição pela presença no meio da rede tridimensional do polímero. Isso seria então análogo à ação dos carragenanos poliméricos no leite com chocolate, que evita a precipitação das partículas de cacau.
A Barex começou com uma coleção de várias dezenas de polímeros. Após seleção por pesquisa in vitro, nomeadamente análise de motilidade espermática durante o armazenamento usando o sistema de análise de sémen assistido por computador CEROS II da Hamilton Thorne, chegámos a três candidatos potenciais. Após seleção adicional usando testes de inseminação, restou um único polímero com uma faixa específica de pesos moleculares. Este polímero foi chamado Matrix.
A Matrix foi extensivamente testada em suínos. As primeiras experiências indicaram que uma única inseminação era suficiente para as porcas ficarem prenhas, em contraste com a prática atual de duas inseminações. A Matrix no meio de diluição para sémen de suínos foi testada por mais de dois anos em várias explorações na Holanda. A conclusão foi que, com apenas uma inseminação, o meio com Matrix aumentou a taxa de parto em 2-4 % e aumentou o tamanho da ninhada em 0,9 -1,7 leitões por ninhada.
Infelizmente, grandes empresas que produzem e vendem diluentes de sémen e consumíveis para IA não estavam interessadas na Matrix porque isso reduziria significativamente o seu volume de negócios. Afinal, apenas uma inseminação era necessária em vez de duas.
Após pesquisar o uso da Matrix em diluentes de sémen de suínos, a Barex começou a desenvolver um diluidor de sémen de coelho. Em 2015, a Barex criou com sucesso o Lepex. A imagem abaixo demonstra a motilidade do esperma de coelho diluído em Lepex durante o armazenamento a 17°C.
A Matrix mostrou um efeito positivo na capacidade de armazenamento do Lepex. Esta e outras experiências mostraram que o Lepex tem uma melhor capacidade de armazenamento do que outros diluidores comerciais de sémen de coelho.
Esperava-se que a Matrix também tivesse um efeito positivo no desempenho reprodutivo dos coelhos. Após várias experiências exploratórias, a percentagem ótima de Matrix foi determinada num ensaio de campo em larga escala.
A imagem abaixo mostra os resultados. Na concentração ótima de Matrix, a taxa de gravidez é 4-5 % mais alta, e o tamanho da ninhada nascida viva é quase um a mais em comparação com um diluidor sem Matrix.
Porex, porexcell, e pronexcell.
Há muitos anos, a Barex descobriu acidentalmente o efeito positivo dos isolados de soro de leite na capacidade de armazenamento dos diluidores de sémen suíno. A adição de 1% de uma marca específica de isolado de soro de leite foi denominada Porex. O Porex foi testado no TRIXCell, o diluidor da IMV Technologies. O TRIXcell+ era o diluidor com Porex. Durante os seis anos de ensaios de inseminação, as 35 explorações que participaram tiveram anualmente uma taxa de partos mais elevada e um maior número de leitões nascidos vivos quando o TRIXcell+ foi utilizado em vez do BTS, o diluidor de referência, resultando numa taxa de partos mais elevada e numa maior dimensão da ninhada.
O TRIXcell+ apresentou um aumento médio de 0,6 no número de leitões nascidos vivos. Estudos anteriores indicaram que o TRIXcell tinha uma taxa de partos e um desempenho de dimensão da ninhada semelhantes ao BTS (Haugan et al., 2007).
O aditivo para o diluidor foi denominado Porex. Uma melhoria adicional do Porex foi a adição de lecitina de soja. Com a adição, o nome foi alterado para Porexcell. Tanto o Porex como o Porexcell têm sido utilizados durante muitos anos em diluidores de sémen suíno.
Por volta de 2014, tornou-se evidente que o efeito positivo do Porexcell diminuiu e até afetou negativamente a capacidade de preservação dos diluidores de sémen suíno. Verificou-se que continha cada vez mais pesticidas ao longo dos anos. Este efeito negativo na motilidade durante o armazenamento do sémen diluído não era percetível em diluidores de sémen de garanhão ou de coelho. Parece que os espermatozoides suínos são altamente suscetíveis aos pesticidas. Foram feitos esforços para desenvolver um produto sem pesticidas; uma vez que não queríamos que o desenvolvimento afetasse as células espermáticas de garanhão e de coelho, acabámos por mudar para uma mistura proteica derivada do leite, mas mais pura do que a proteína do soro de leite. O novo produto foi denominado Pronexcell. Até hoje, o Pronexcell é utilizado nos diluidores de sémen Hippex para esperma de garanhão e no Lepex, o diluidor de esperma de coelho.
Os efeitos positivos destas proteínas contribuem para o desempenho da Matrix.
8. Matrixcell.
Os resultados das experiências iniciais indicaram que o Novum tem um desempenho muito bom. Foi necessário adicionar ingredientes adicionais para alcançar um desempenho semelhante ao da utilização de GnRH. Como referido acima, a proteína NGF interage com dois recetores, TrkA e p75, que podem ser encontrados em todo o trato reprodutivo feminino para induzir a ovulação. São necessárias múltiplas ativações dos recetores, e a resposta é diretamente proporcional ao número de encontros NGF-recetor por unidade de tempo. A transdução eficaz do sinal requer concentrações adequadas e um ambiente bioquímico apropriado. Um diluidor de sémen tem um meio bioquímico muito diferente do muco vaginal. A superfície do trato reprodutivo feminino está coberta de muco, um gel viscoelástico complexo que atua como primeira linha de defesa contra agentes nocivos do ambiente externo. O muco desempenha um papel essencial em muitas funções biológicas. O muco alberga a flora vaginal, crucial na manutenção da barreira mucosa vaginal. Para melhorar a mistura do sémen diluído com o muco e permitir que o NGF interaja com os seus recetores, o Matrixcell é um dos ingredientes críticos do Novum.
Matrixcell.
A administração de NGF no local dos recetores no trato reprodutivo feminino pode ser afetada pelo muco em numerosas pregas, cavidades e sulcos no epitélio, que aumentam a área de superfície da vagina e proporcionam distensibilidade. Além disso, as fugas podem reduzir a quantidade de NGF disponível para interação com os recetores. Com a aplicação da IA, há menos dinâmica dos fluidos vaginais e forças biomecânicas naturais do que com o acasalamento natural.
Assim, a eficácia da atividade do NGF depende de concentrações adequadas e da retenção na superfície das paredes do trato reprodutivo. A Matrix mucoadesiva provou ser bem-sucedida, prolongando a presença do NGF na mucosa através da formação de ligações físicas e químicas com o muco. No entanto, para melhorar a penetração do NGF no muco, foi utilizado o Matrixcell, que é uma forma mais pura e refinada da Matrix.
A penetração do muco engloba diferentes fases. A primeira estabelece um contacto íntimo entre o meio de inseminação e o muco e envolve a dispersão do meio. Na segunda fase, ocorre uma interpenetração entre os polímeros da Matrix e as glicoproteínas do muco através da formação de emaranhamentos físicos entre as duas espécies macromoleculares. Em particular, o Matrixcell tem um desempenho melhor do que a Matrix nesta fase, como indicado por experiências in vitro. Na terceira fase, ocorre a consolidação, fortalecendo a ligação polímero Matrix-mucina através da criação de forças de Van der Waals e ligações de hidrogénio.
9. Tempo de semi-vida do NGF
A presença de peptidases tanto no sémen diluído como no trato reprodutivo feminino afeta o tempo de semi-vida do NGF na dose de inseminação. As peptidases são encontradas no plasma seminal do coelho, principalmente provenientes do epidídimo e das glândulas sexuais acessórias, enquanto os micróbios colonizam o trato reprodutivo feminino e também secretam peptidases. Tanto o esperma como o fluido vaginal contêm enzimas que degradam proteínas.
O Matrixcell, presente no diluidor, atua como um gel para prolongar o tempo de semi-vida do NGF. Além disso, o tempo de semi-vida das proteínas NGF foi prolongado através da adição de um cocktail de inibidores de enzimas que degradam proteínas, péptidos competitivos e proteínas (entre outros, Pronexcell).
10. Observações finais
Os novos conhecimentos sobre a reprodução dos coelhos levaram ao desenvolvimento do novo suplemento diluidor de sémen Novum. Os vários ingredientes únicos do Novum apoiam os mecanismos moleculares que conduzem à ovulação e gravidez no coelho. O excelente desempenho do Novum foi confirmado por várias experiências em diferentes locais em vários países.
