Tło biochemiczne.
Wprowadzenie.
W 2015 roku firma Barex opracowała medium do konserwacji nasienia królików Lepex, które od tego czasu jest dostępne na rynku. Niedawno nowa wiedza na temat mechanizmów biochemicznych związanych z rozmnażaniem królików doprowadziła do opracowania nowego suplementu Novum (Novum od New Ovulation Medium). Suplement Novum, dodawany do rozcieńczalnika nasienia, jest przełomowym sposobem wspomagania indukcji owulacji. Składniki obecne w Novum są specjalnie zaprojektowane, aby wspomóc białko beta czynnika wzrostu nerwów (NGF) naturalnie obecne w nasieniu samca w indukowaniu owulacji. Wspierając różne mechanizmy molekularne zaangażowane w naturalny proces owulacji, Novum umożliwia naturalną owulację indukowaną kryciem. W kolejnych akapitach zagłębimy się w kluczowe elementy rozwoju Novum i przedstawimy szczegółowe informacje o procesach molekularnych rozmnażania u królików.
Króliki europejskie to małe ssaki należące do rodziny zającowatych. Były one polowane i spożywane przez hominidy w epoce kamienia w dużych ilościach na obszarach północno-zachodniego Morza Śródziemnego, od Hiszpanii po Włochy. Fenicjanie, którzy handlowali na całym obszarze Morza Śródziemnego od Cypru po Półwysep Iberyjski, prawdopodobnie zapoczątkowali rozprzestrzenianie się królików. Rzymianie odkryli królika jako źródło pożywienia, a handel w Imperium Rzymskim przyczynił się do dalszego rozprzestrzeniania się królików z Półwyspu Iberyjskiego do innych części świata. Udomowienie trwało aż do XVIII wieku. Obecnie króliki są hodowane jako większe i tłustsze, aby uzyskać więcej mięsa. Zostały wprowadzone na całym świecie w wielu kulturach i są częścią codziennego życia jako źródło pożywienia, odzieży, towarzysz i źródło inspiracji artystycznej. Króliki są wykorzystywane jako model badawczy w naukach podstawowych, a w naukach stosowanych są wykorzystywane między innymi do produkcji przeciwciał, które mogą być stosowane u ludzi lub do badania chorób ludzkich.
2. Produkcja mięsa króliczego.
Królik jest dobrym źródłem mięsa, aby zaspokoić zapotrzebowanie na białko zwierzęce. Przy optymalnym programie hodowlanym samica królika może wyprodukować 60 młodych królików rocznie, co stanowi ponad 100 kg mięsa króliczego. Ponadto króliki mają wysoki wskaźnik reprodukcji w porównaniu z innymi zwierzętami hodowlanymi. Osiągają dojrzałość płciową wcześniej, mają stosunkowo krótki okres ciąży i mogą być ponownie kryte natychmiast po porodzie. Sztuczne unasiennianie (AI) samic królików pojawiło się na europejskich farmach pod koniec lat 80. XX wieku. Wcześniej było stosowane w celu uzyskania poprawy genetycznej zwierząt i rozwiązania problemów sanitarnych. Później osiągnięto znaczące ulepszenia zarówno w aspektach produkcyjnych, jak i ekonomicznych. Technika sztucznego unasienniania królików nadal ewoluuje.
Szanowni Państwo,
W nadchodzących dekadach zapotrzebowanie na produkty hodowlane wzrośnie wraz z dramatycznym wzrostem populacji światowej, a konsumenci staną się bardziej świadomi i wymagający wysokiej jakości produktów. Hodowla królików, szczególnie ważna w obszarze śródziemnomorskim i półsuchych strefach Afryki, Azji czy Ameryki, stanowi cenne alternatywne źródło dobrego białka zwierzęcego o wysokiej jakości (niska zawartość tłuszczu i cholesterolu). Ponieważ króliki są wybierane na całym świecie jako gatunek hodowlany ze względu na ich zalety reprodukcyjne i żywieniowe, nowoczesna hodowla królików stanie przed ważnymi wyzwaniami w najbliższych latach, które muszą zostać rozwiązane, aby pozostała konkurencyjnym i zrównoważonym sektorem. Należy zastosować różne strategie, aby utrzymać równowagę między dobrostanem królików, wymaganiami klientów i potrzebami hodowców. Konieczna jest poprawa systemów hodowli, co może obejmować unikanie hormonów i antybiotyków; zwiększenie efektywności procedur reprodukcyjnych, takich jak systemy sztucznego unasienniania czy mrożenie nasienia i zarodków; wydłużenie okresu produkcyjnego samic; oraz dostosowanie systemów żywieniowych w celu optymalizacji stanu fizjologicznego zwierząt. Celem tego Specjalnego Wydania było opublikowanie wysokiej jakości manuskryptów, w tym oryginalnych badań i przeglądów, które głównie dotyczą któregokolwiek z tych tematów w zakresie zwiększania produktywności i zrównoważonego rozwoju hodowli królików.
Dr Rosa María García-García
Dr Maria Arias Alvarez
Redaktorzy Gościnni
3. Sztuczne unasiennianie królików.
Komercyjne wykorzystanie AI w hodowli królików jest stosunkowo niedawne. Masowe stosowanie AI w hodowli królików rozpoczęło się pod koniec lat 80. XX wieku. Dzięki AI królików możliwe jest zwiększenie ilości wysokiej jakości produktów uzyskiwanych przy niskich kosztach pracy, w przeciwieństwie do stosowania naturalnego krycia. Łatwiej jest stworzyć warunki jakościowe dla utrzymania małej liczby samców. Wskaźniki zapłodnienia po AI świeżym nasieniem są równoważne lub nawet lepsze niż te uzyskiwane przy naturalnym kryciu.
Dalsze zalety to: możliwość kontroli jakości potomstwa, zwiększenie liczby osobników o cennych, funkcjonalnych cechach, przedłużona płodność nawet w niekorzystnych porach roku, produkcja oparta na cyklu całorocznym oraz bardziej efektywne programy hodowlane.
AI było stosowane wcześniej, przed zastosowaniami na dużą skalę, w celu uzyskania poprawy genetycznej zwierząt i rozwiązania problemów sanitarnych. Jednak później osiągnięto znaczące ulepszenia zarówno w aspektach produkcyjnych, jak i ekonomicznych, takie jak przyspieszenie pożądanych cech o wysokiej wartości genetycznej wspierane przez konserwację nasienia.
Systematyczne stosowanie AI w intensywnej produkcji królików jest jednym z najbardziej efektywnych sposobów dystrybucji ejakulatów od samców o wyższej jakości lub wartości genetycznej. Krótko mówiąc: AI oferowało dużym farmom możliwość optymalizacji warunków dla wysoce ekonomicznej produkcji mięsa króliczego.
Wiele ssaków utrzymuje, że owulacja jest regulowana przez steroidy jajnikowe uwalniane z dojrzałych jajników. Te steroidy wywołują uwalnianie hormonu uwalniającego gonadotropinę (GnRH) z podwzgórza. Te ssaki nazywane są spontanicznymi owulatorami.
Króliki są jednak owulatorami indukowanymi. Oznacza to, że owulacja jest indukowana przez krycie, które wyzwala wydzielanie GnRH. Dlatego, gdy stosuje się AI zamiast naturalnego krycia w hodowli królików na dużą skalę, należy zastosować hormon uwalniający gonadotropinę (GnRH) w celu wywołania owulacji.
Aplikacja GnRH może być wykonana na kilka sposobów, ale głównie odbywa się poprzez wstrzyknięcie domięśniowe samicy lub podanie dopochwowe.
Przykładami dostępnych w handlu syntetycznych GnRH jako leków weterynaryjnych są Receptal firmy MSD Animal Health (część amerykańskiej firmy Merck & Co) i Dalmarelin firmy Fatro (z siedzibą we Włoszech). Receptal zawiera 4,2 mcg busereliny na ml, a Dalmarelin zawiera 25 mcg lecireliny na ml.
Po wstrzyknięciu domięśniowym agonista jest wchłaniany do naczyń krwionośnych tkanki mięśniowej i rozprowadzany w organizmie. Natychmiastowa reakcja…
Wejście agonisty do krwi powoduje natychmiastowe uwolnienie hormonu luteinizującego z przedniego płata przysadki mózgowej, co prowadzi do owulacji.
Do podania dopochwowego potrzeba około dziesięć razy więcej agonisty, ponieważ cząsteczki GnRH muszą przejść przez ścianę pochwy, aby dotrzeć do naczyń krwionośnych. Oprócz przejścia przez ścianę, środowisko pochwy jest nieprzyjazne dla zewnętrznego białka.
5. Hormon GnRH
Hormon jest substancją regulacyjną produkowaną w organizmie i transportowaną w płynach tkankowych, takich jak krew, w celu stymulacji określonych komórek lub tkanek do działania. Hormon gonadotropowy to hormon, który działa na lub stymuluje gonady, tj. narząd produkujący komórki plemnikowe (jądro) lub komórki jajowe (jajnik).
Hormon uwalniający gonadotropinę (GnRH) jest hormonem uwalniającym odpowiedzialnym za uwalnianie hormonu folikulotropowego (FSH) i hormonu luteinizującego (LH) z przedniego płata przysadki mózgowej. GnRH jest tropowym hormonem peptydowym syntetyzowanym i uwalnianym z neuronów GnRH w podwzgórzu.
GnRH jest małym białkiem lub peptydem składającym się z 10 aminokwasów.
Tożsamość GnRH została wyjaśniona przez laureatów Nagrody Nobla z 1977 roku, Rogera Guillemina i Andrew V. Schally’ego. Okres półtrwania GnRH wynosi tylko 2-4 minuty, ponieważ cząsteczka jest szybko rozkładana przez enzymy proteolityczne, zwane również peptydazami. Krótki okres półtrwania był powodem, dla którego syntetyzowano analogi GnRH w celu zwiększenia ich siły działania i czasu trwania działania do zastosowań jako leki dla ludzi.
Do podawania ssakom stosuje się syntetyczny GnRH. Cząsteczki te nazywane są agonistami lub analogami GnRH. Syntetyczny GnRH jest stosowany do wywołania owulacji u królików. Cząsteczki te nazywane są agonistami lub analogami GnRH. Analogi różnią się nieznacznie od naturalnego (ludzkiego) dekapeptydowego GnRH, ale z określonymi modyfikacjami. Modyfikacje te to pojedyncze lub podwójne podstawienia określonych aminokwasów (w pozycji aminokwasowej 6). Ale występują również zmiany w pozycji 9 (alkilacja) lub usunięcie pozycji 10. Modyfikacje te mogą hamować szybki rozkład w płynach ustrojowych przy zachowaniu funkcji. Agonistami z dwoma podstawieniami aminokwasów są leuprorelina, buserelina, goserelina i deslorelina. Środki nafarelina i tryptorelina są agonistami z pojedynczymi podstawieniami w pozycji 6.
6. Owulacja indukowana NGF jako alternatywa.
Do kilku lat temu uważano, że owulacja u królików może być indukowana tylko przez kopulację. Pogląd był taki, że główny mechanizm zaangażowany w uwalnianie GnRH wśród indukowanych owulatorów polega na aktywacji neuronów noradrenergicznych w odpowiedzi na genitalne sygnały somatosensoryczne generowane przez otrzymanie intromisji od samca podczas krycia. Te neurony noradrenergiczne miałyby następnie promować uwalnianie GnRH. Jednak najnowsze badania nad molekularnymi podstawami rozmnażania u królików wskazują, że białko beta czynnika wzrostu nerwów (NGF) odgrywa kluczową rolę jako czynnik indukujący owulację.
Czynnik wzrostu nerwów (NGF) jest białkiem i czynnikiem neurotroficznym, który reguluje wzrost, utrzymanie, proliferację i przeżycie określonych neuronów docelowych. Ale wiele lat po jego odkryciu stało się jasne, że NGF odgrywa również istotną rolę w rozmnażaniu, szczególnie u gatunków z indukowaną owulacją.
Efekt NGF na komórki docelowe jest mediowany przez dwa receptory: kinazę receptora tropomiozyny A (TrKA), która selektywnie wiąże.
NGF, oraz receptor neurotrofiny p75. Receptory te znajdują się w kilku miejscach w układzie rozrodczym samicy.
Poprzez interakcję z receptorami, białko NGF indukuje owulację, ale wpływa również na układ rozrodczy samicy podczas i po owulacji. Ponadto odgrywa rolę w środowisku biochemicznym podczas wczesnego rozwoju zarodka.
NFG może działać jako czynnik indukujący owulację poprzez dwa rodzaje mechanizmów w żeńskim układzie rozrodczym. Po pierwsze, NGF może stymulować neurony czuciowe macicy i szyjki macicy, które pobudzają neurony w podwzgórzu. Po drugie, NGF może powodować dalszą syntezę NGF w układzie rozrodczym, który wraz z tym pochodzącym z nasienia, jest przenoszony przez krew i kieruje się do mózgu, prowadząc ostatecznie do uwolnienia GnRH.
Najbardziej przekonującym dowodem na kluczową rolę NFG jest to, że syntetyczny NGF (rekombinowane białko identyczne z NGF występującym u królików) dodany do rozcieńczonego nasienia indukuje owulację i zapłodnienie drogą dopochwową. Owulacja zachodzi w sposób zależny od dawki. Uzyskano zdrowe potomstwo, nie wykazujące różnic w porównaniu z GnRH.
Wyłania się następujący obraz. Podczas krycia deponowane jest około 1 ml ejakulatu zawierającego około 300 milionów plemników zawieszonych w plazmie nasiennej zawierającej NGF. Poprzez działanie NGF inicjowana jest seria kilku funkcji molekularnych i komórkowych. Gdy plemniki docierają do jajowodu, co u królików następuje w ciągu kilku minut, tylko niewielka liczba plemników przyłącza się do nabłonka jajowodu. Owulacja jest indukowana około dziesięć godzin po kopulacji, a zapłodnienie następuje 2-3 godziny po owulacji. Wszystkie te zdarzenia wynikają z endokrynnej i neuronalnej interakcji związanej z kopulacją, przy czym NFG odgrywa kluczową rolę.
NGF stanowi alternatywę dla stosowania GnRH. Ponadto oczekuje się, że NGF będzie odgrywać istotną rolę w przyszłości inseminacji u wielu innych zwierząt.
7. Czy matryca w Lepex poprawia funkcjonowanie owulacji indukowanej NGF?
Rozcieńczalnik nasienia królików Lepex zawiera Matrix, polimer. Jak wspomniano powyżej, ten rozcieńczalnik został opracowany w 2015 roku i był używany w Stacji Inseminacji Królików Petera Rutjensa. W niedawnych eksperymentach, których celem było wykorzystanie specyficznych peptydów przeciwbakteryjnych, zaobserwowano dobre wyniki bez konieczności stosowania domięśniowych iniekcji analogu GnRH. Skłoniło nas to do przypuszczenia, że Matrix w jakiś sposób poprawił funkcjonowanie owulacji indukowanej NGF.
Molekularny mechanizm działania Matrixu w zastosowaniu rozcieńczalnika jest wieloraki; po pierwsze, komórki plemników mniej się zlepiają; po drugie, występuje mniejszy odpływ rozcieńczonego nasienia po inseminacji; po trzecie, co najważniejsze, Matrix działa jako substancja mukoadhezyjna. W tym momencie przypuszczaliśmy, że nieoczekiwany pozytywny wynik naszych eksperymentów był spowodowany poprawą owulacji mediowanej przez NGF u królików, z kluczową rolą Matrixu.
Matrix, nowa rola w zastosowaniu NGF
W latach 2012 i 2013 firma Barex badała różne polimery do zastosowania w mediach konserwujących nasienie świń, aby zapobiec wytrącaniu się komórek w rozcieńczeniu poprzez obecność w medium trójwymiarowej sieci polimeru. Miało to być analogiczne do działania polimerycznych karagenianów w mleku czekoladowym, które zapobiegają wytrącaniu się cząstek kakao.
Barex rozpoczął od kolekcji kilkudziesięciu polimerów. Po selekcji poprzez badania in vitro, a mianowicie analizę ruchliwości plemników podczas przechowywania przy użyciu komputerowego systemu analizy nasienia CEROS II firmy Hamilton Thorne, wyłoniliśmy trzech potencjalnych kandydatów. Po dalszej selekcji przy użyciu testów inseminacyjnych pozostał pojedynczy polimer o specyficznym zakresie mas cząsteczkowych. Polimer ten nazwano Matrix.
Matrix został szeroko przetestowany na świniach. Pierwsze eksperymenty wskazywały, że pojedyncza inseminacja była wystarczająca, aby lochy zaszły w ciążę, w przeciwieństwie do obecnej praktyki dwukrotnej inseminacji. Matrix w medium rozcieńczającym nasienie świń był testowany przez ponad dwa lata w różnych gospodarstwach w Holandii. Wniosek był taki, że przy tylko jednej inseminacji medium z Matrixem zwiększyło wskaźnik oproszenia o 2-4% i zwiększyło wielkość miotu o 0,9-1,7 prosiąt na miot.
Niestety, duże firmy produkujące i sprzedające rozcieńczalniki nasienia oraz materiały eksploatacyjne do sztucznej inseminacji nie były zainteresowane Matrixem, ponieważ zawsze znacząco zmniejszałoby to ich obroty. W końcu potrzebna była tylko jedna inseminacja zamiast dwóch.
Po zbadaniu zastosowania Matrixu w rozcieńczalnikach nasienia świń, Barex rozpoczął prace nad rozcieńczalnikiem nasienia królików. W 2015 roku Barex z powodzeniem stworzył Lepex. Poniższy obraz demonstruje ruchliwość plemników królika rozcieńczonych w Lepexie podczas przechowywania w temperaturze 17°C.
Matrix wykazał pozytywny wpływ na zdolność przechowywania Lepexu. Ten i inne eksperymenty wykazały, że Lepex ma lepszą zdolność przechowywania niż inne komercyjne rozcieńczalniki nasienia królików.
Oczekiwano, że Matrix będzie miał również pozytywny wpływ na wydajność reprodukcyjną królików. Po kilku eksperymentach rozpoznawczych, optymalny procent Matrixu został określony w dużej próbie terenowej.
Poniższy obraz pokazuje wyniki. Przy optymalnym stężeniu Matrixu wskaźnik ciąż jest o 4-5% wyższy, a wielkość miotu urodzonych żywych jest prawie o jedno wyższa w porównaniu z rozcieńczalnikiem bez Matrixu.
Porex, Porexcell i Pronexcell.
Wiele lat temu Barex przypadkowo odkrył pozytywny wpływ izolatów serwatki na zdolność przechowywania rozcieńczalników nasienia świń. Dodanie 1% konkretnej marki izolatu serwatki nazwano Porex. Porex został przetestowany w TRIXCell, rozcieńczalniku firmy IMV Technologies. TRIXcell+ był rozcieńczalnikiem z Porexem. Podczas sześciu lat prób inseminacyjnych, 35 gospodarstw, które uczestniczyły, miało każdego roku wyższy wskaźnik oproszenia i większą liczbę żywo urodzonych prosiąt, gdy używano TRIXcell+ zamiast BTS, rozcieńczalnika referencyjnego.
TRIXcell+ wykazał średni wzrost liczby żywo urodzonych prosiąt o 0,6. Wcześniejsze badania wskazywały, że TRIXcell miał podobny wskaźnik oproszenia i wielkość miotu jak BTS (Haugan i in., 2007).
Dodatek do rozcieńczalnika nazwano Porex. Dalszym ulepszeniem Porexu było dodanie lecytyny sojowej. Po dodaniu, nazwa została zmieniona na Porexcell. Zarówno Porex, jak i Porexcell były używane przez wiele lat w rozcieńczalnikach nasienia świń.
Około 2014 roku stało się jasne, że pozytywny efekt Porexcellu zmalał, a nawet negatywnie wpłynął na zdolność konserwacji rozcieńczalników nasienia świń. Okazało się, że z biegiem lat zawierał on coraz więcej pestycydów. Ten negatywny wpływ na ruchliwość podczas przechowywania rozcieńczonego nasienia nie był zauważalny w rozcieńczalnikach nasienia ogierów lub królików. Wydaje się, że plemniki świń są wysoce podatne na pestycydy. Podjęto wysiłki w celu opracowania produktu bez pestycydów; ponieważ nie chcieliśmy, aby rozwój wpłynął na plemniki ogierów i królików, ostatecznie zmieniliśmy na mieszankę białkową pochodzącą z mleka, ale czystszą niż białko serwatkowe. Nowy produkt nazwano Pronexcell. Do dziś Pronexcell jest używany w rozcieńczalnikach nasienia Hippex dla plemników ogierów i w Lepexie, rozcieńczalniku nasienia królików.
Pozytywne efekty tych białek dodają się do wydajności Matrixu.
8. Matrixcell.
Wyniki wstępnych eksperymentów wskazywały, że Novum działa bardzo dobrze. Należało dodać dodatkowe składniki, aby osiągnąć wydajność podobną do stosowania GnRH. Jak napisano powyżej, białko NGF oddziałuje z dwoma receptorami, TrkA i p75, które można znaleźć w całym żeńskim układzie rozrodczym, aby wywołać owulację. Konieczne są wielokrotne aktywacje receptorów, a odpowiedź jest bezpośrednio proporcjonalna do liczby spotkań NGF-receptor na jednostkę czasu. Efektywna transdukcja sygnału wymaga odpowiednich stężeń i odpowiedniego środowiska biochemicznego. Rozcieńczalnik nasienia ma bardzo odmienne środowisko biochemiczne niż śluz pochwowy. Powierzchnia żeńskiego układu rozrodczego jest pokryta śluzem, złożonym lepkosprężystym żelem, który działa jako pierwsza linia obrony przed szkodliwymi czynnikami z zewnętrznego środowiska. Śluz odgrywa istotną rolę w wielu funkcjach biologicznych. Śluz jest domem dla flory pochwowej, kluczowej w utrzymaniu bariery śluzówki pochwy. Aby poprawić mieszanie się rozcieńczonego nasienia ze śluzem i umożliwić NGF interakcję z jego receptorami, Matrixcell jest jednym z kluczowych składników Novum.
Matrixcell.
Dostarczanie NGF w miejscu receptorów w żeńskim układzie rozrodczym może być zakłócone przez śluz w licznych fałdach, jamach i grzbietach nabłonka, które zwiększają powierzchnię pochwy i zapewniają rozciągliwość. Ponadto, wyciek może zmniejszyć ilość NGF dostępnego do interakcji z receptorami. Przy zastosowaniu sztucznej inseminacji występuje mniej dynamiki płynów pochwowych i naturalnych sił biomechanicznych niż przy naturalnym kryciu.
Zatem skuteczność aktywności NGF zależy od odpowiednich stężeń i retencji na powierzchni ścian układu rozrodczego. Mukoadhezyjny Matrix okazał się skuteczny, przedłużając obecność NGF w śluzówce poprzez tworzenie fizycznych i chemicznych wiązań ze śluzem. Jednak aby poprawić penetrację NGF do śluzu, zastosowano Matrixcell, który jest czystszą i bardziej rafinowaną formą Matrixu.
Penetracja śluzu obejmuje różne fazy. Pierwsza ustanawia intymny kontakt między medium inseminacyjnym a śluzem i obejmuje rozprzestrzenianie się medium. W drugiej fazie zachodzi interpenetracja między polimerami Matrixu a glikoproteinami śluzu poprzez tworzenie fizycznych splątań między dwoma gatunkami makromolekularnymi. W szczególności Matrixcell działa lepiej niż Matrix w tej fazie, co wykazały eksperymenty in vitro. W trzeciej fazie następuje konsolidacja, wzmacniająca wiązanie polimeru Matrix-mucyna poprzez tworzenie sił Van der Waalsa i wiązań wodorowych.
9. Okres półtrwania NGF
Obecność peptydaz zarówno w rozcieńczonym nasieniu, jak i w żeńskim układzie rozrodczym wpływa na okres półtrwania NGF w dawce inseminacyjnej. Peptydazy znajdują się w plazmie nasiennej królików, głównie pochodzącej z najądrza i dodatkowych gruczołów płciowych, podczas gdy mikroby kolonizujące żeński układ rozrodczy również wydzielają peptydazy. Zarówno nasienie, jak i płyn pochwowy zawierają enzymy rozkładające białka.
Matrixcell, obecny w rozcieńczalniku, działa jako żel, aby przedłużyć okres półtrwania NGF. Dodatkowo, okres półtrwania białek NGF został wydłużony poprzez dodanie koktajlu inhibitorów enzymów rozkładających białka, konkurencyjnych peptydów i białek (m.in. Pronexcell).
10. Uwagi końcowe
Nowe spojrzenie na reprodukcję królików doprowadziło do opracowania nowego suplementu do rozcieńczalnika nasienia – Novum. Różne unikalne składniki Novum wspierają molekularne mechanizmy prowadzące do owulacji i ciąży u królików. Doskonała wydajność Novum została potwierdzona przez kilka eksperymentów w różnych lokalizacjach w kilku krajach.
